Автореферат диссертации по медицине на тему Совершенствование методов иммунодетекции HBsAg-мутантов вируса гепатита B
На правах рукописи
Баженов Алексей Иванович
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ИММУНОДЕТЕКЦИИ HBsAg-MУTAHTOB ВИРУСА ГЕПАТИТА В
14.00.36 - аллергология и иммунология 14.00.46 - клиническая лабораторная диагностика
2 2 ОПТ
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Москва - 2009
003481000
Работа выполнена в Государственном учреждении здравоохранения Научно-исследовательском институте скорой помощи имени Н.В.Склифосовского Департамента здравоохранения г. Москвы и в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи РАМН.
Научные руководители:
доктор медицинских наук Анатолий Петрович Суслов кандидат медицинских наук Михаил Андреевич Годков
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Вячеслав Федорович Лавров доктор медицинских наук, профессор Владимир Владимирович Долгов
Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Российская Медицинская Академия последипломного образования» Минздравсоцразвития
Защита диссертации состоится «/? » 2009 года в Д часов на заседа-
нии диссертационного совета Д 001.007.01 в НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН (123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 18)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи
Автореферат разослан
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук, профессор
Екатерина Владимировна Русакова
Актуальность проблемы
Важным условием осуществления надлежащего контроля за гепатитом В является постоянное повышение качества иммунодиагностикумов для выявления HBsAg - основного диагностического маркера вируса гепатита В (ВГВ). Наибольшее распространение в рутинной лабораторной практике получило определение HBsAg методом иммуноферментного анализа (ИФА). В настоящее время все коммерческие тест-системы, применяемые на территории РФ, выявляют HBsAg в концентрации не менее 0,1 нг/мл (приказ МЗ РФ №322 от 2002 г.). Тем не менее, способность выявлять малые количества HBsAg вируса «дикого» типа не исключает полностью возможность получения ложноотрицательных результатов. Это обусловлено существованием «ускользающих» мутантов ВГВ (escape-mutants), отличительной чертой которых является экспрессия HBsAg с атипичными серологическими свойствами. Данная проблема впервые была обозначена в 90-е годы прошлого века (Carman, 1991). Именно тогда появились первые сообщения о носителях ВГВ с необычными вариантами HBsAg, которые плохо или вовсе не выявлялись существовавшими тестами. В дальнейшем вирусы с такими свойствами стали называть HBsAg-мутантами.
Массовая вакцинация против гепатита В (ГВ), реализуемая во многих странах мира в ранге национальных программ, наряду с использованием препаратов анти-HBs для лечения ГВ способствуют преимущественной селекции и распространению мутантных форм ВГВ, которые не только «ускользают» из-под протективного действия поствакцинального иммунитета, но и плохо или вовсе не выявляются тестами, основанными на иммунодетек-ции HBsAg (Weber В, 2004).
Все это определило высокую актуальность работы по выявлению HBsAg-мутантов ВГВ, изучению их серологических и генетических свойств, накоплению данных об эпидемиологическом значении HBsAg-мутантов ВГВ, оценке диагностического потенциала вакцин в отношении инфекции, вызванной мутантными штаммами ВГВ, созданию тест-систем, адаптирован-
ных к выявлению мутантных вариантов НВзА, а также диагностикумов, позволяющих проводить дифференцированный скрининг мутантных форм ВГВ.
Цель работы:
Провести поиск HBsAg-мyтaнтoв ВГВ среди хронических НВзА§-позитивных носителей ВГВ, изучить их распространенность, серологические, генетические свойства и разработать методические подходы, направленные на улучшение серологической диагностики и профилактики ГВ
Задачи исследования:
1. Разработать алгоритм серологического поиска НВзАв-мутантов ВГВ
2. Осуществить генетическую и серологическую характеристику НВзА§-мутантов и оценить их распространение
3. Создать контрольные панели сывороточных образцов, содержащих му-тантные варианты HBsAg
4. Охарактеризовать способность коммерческих ИФА тест-систем выявлять мутантный НВзА§
5. Оценить протективный потенциал вакцин в отношении НВ5А-мутантов ВГВ
Научная новизна работы
Впервые установлен факт циркуляции и определено распространение мутантов ВГВ 014511 и 81431/П43М в популяции HBsAg-пoзитивныx носителей Московского региона. Впервые выявлен мутант 014511 редкого субтипа ас1\уЗ генотипа Б.
Впервые разработана методика серологического «портретирования» HBsAg, позволяющая проводить анализ эпитопных модификаций этого антигена с помощью панели моноклональных антител (МАТ) к HBsAg, коньюги-рованных с пероксидазой хрена (МАТ-ПХ).
С помощью серологического «портретирования» впервые были выявлены существенные серологические различия природных и рекомбинантных форм мутантного НВэА§.
Впервые показана принципиальная возможность определять вид мутаций в 8-гене по серологическим свойствам НВзА§ и создан тест серологического поиска мутантов ВГВ 014511 и Б1431/1143М.
Впервые с помощью разработанной контрольной панели, содержащей му-тантные варианты HBsAg, проведена сравнительная характеристика диагностического потенциала коммерческих тест-систем, широко распространенных на рынке РФ, и определены конструктивные особенности тест-систем, позволяющие эффективно выявлять мутантный НВзАд.
Впервые разработан тест, позволяющий оценивать эффективность гуморального иммунитета у вакцинированных и переболевших ГВ в отношении мутантов ВГВ и показано, что у вакцинированных различными вакцинами («Энджерикс», «Твинрикс») практически отсутствуют антитела против наиболее известного НВзА§-мутанта ВГВ 014511.
Положения, выносимые на защиту
1. Установлен факт циркуляции 014511, 8143Г, Т143М НВэАя-мутантов ВГВ среди хронических носителей ВГВ Московского региона, в том числе 014511 НВзА-мутанта с редким для генотипа Б субтипом ай\уЗ.
2. Разработан подход изучения эпитопных модификаций HBsAg при помощи панели моноклональных анти-НВзА§ конъюгатов (серологическое «портретирование»), что позволило определить значительные различия антигенных свойств рекомбинантного и природного НВзА§ с заменами в 145 и 143 положениях.
3. При помощи панели сывороточных образцов, содержащих мутантные варианты НВзА§, выявлено значительное снижение чувствительности тест-систем для детекции НВзА§, основанных исключительно на МАТ, в отношении НВзА§ с заменами 014511, ЯМЗЬ.
4. Установлено практически полное отсутствие антител, способных взаимодействовать с мутантным HBsAg 0145Я, у лиц привитых против гепатита В вакцинами Энжерик и Твинрикс.
Практическая значимость работы
1. Данные, полученные в ходе серологического поиска, явились основанием для разработки комплекса мер, направленных на повышение качества тест-систем для выявления HBsAg и усиления профилактического потенциала вакцин против гепатита В, который включает: проведение мониторинга за циркуляцией HBsAg-мутантов ВГВ, изучение их серологических и генетических свойств, создание контрольных панелей мутантного HBsAg, разработку тест-систем и вакцин, адаптированных к серологической атипии HBsAg-мутантов ВГВ.
2. Серологическое «портретирование» позволило осуществить развернутую характеристику эпитопных модификаций антигенов, вызванных различными конформационными изменениями, что имеет большое практическое значение при создании вакцин и диагностических тест-систем, разрабатываемых с учетом вариабельности ВГВ.
3. Созданная контрольная панель мутантных вариантов HBsAg позволит оценивать диагностический потенциал вновь создаваемых и существующих тест-систем для выявления HBsAg в отношении мутантных форм ВГВ с заменами G145R и S143L.
4. На основе данных сравнительных испытаний 7 коммерческих ИФА тест-систем по их способности выявлять мутантный HBsAg выявлена недостаточная чувствительность к HBsAg G145R у 4 и HBsAg S143L у 2 из них. Кроме того, определены конструктивные особенности тест-систем, в наибольшей степени обеспечивающие достижение одинаково высокой чувствительности к HBsAg мутантов и ВГВ «дикого» типа.
5. Данные по изучению эффективности гуморального иммунитета у лиц, вакцинированных против ГВ, позволили сделать вывод о недостаточном профилактическом потенциале этих вакцин в отношении HBsAg-мутантов ВГВ и необходимости создания вакцин нового поколения, способных защищать от этих мутантов ВГВ.
Внедрение полученных результатов в практику
1. Сывороточные образцы, содержащие НВэА§ с мутациями 014511 и 8143Ь/Т143М, вошли в панель производства ЗАО «Вектор-Бест».
2. Созданная панель апробирована в ГУЗМ НИИ СП им.Н.В.Склифосовского, НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи РАМН, НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им.М.П.Чумакова, РАМН.
3. Диагностическая тест-система «Гепастрип-мутант» апробирована в МГС СПИД, ГНЦ РАМН, ГУЗМ НИИ СП им.Н.В.Склифосовского.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены: на VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вирусные гепатиты - проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики» (Москва, 2007 год); XV международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии (Украина, Крым, Гурзуф, 2007), XVI международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии (Украина, Крым, Гурзуф, 2008).
Апробация диссертации состоялась 29 мая 2009 г. на заседании проблемно-плановой комиссии №9 ГУЗМ НИИ СП им.Н.В.Склифосовского.
Публикации.
Структура и объём диссертации.
Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 6 глав собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы, состоящего из 163 работ. Диссертация изложена на 147 страницах машинописного текста, включает 22 таблицы и 24 рисунка.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Материалы и методы.
В работе использовали 2510 случайно отобранных HBsAg-позитивных образцов, полученных в ходе скрининга более 400 тысяч пациентов ЛПУ трех округов г. Москвы за период 2004-2005 гг.
Для выявления HBsAg использовали сертифицированные тест-системы отечественного и зарубежного производства: Гепастрип В (ООО «НИАРМЕ-ДИК ПЛЮС», Россия), Вектогеп HBs-антиген (ЗАО «Вектор-Бест», Россия), HBsAg/м (НПО «Диагностические системы», Россия), Vidas HBsAg Ultra («bioMrieux», Франция), Murex HBsAg v.3 («Abbott-Murex», Великобритания), AxSym HBsAg V2 («Abbott Diagnostics», США), IMMULITE 2000 HBsAg («DPC», США).
Для определения дополнительных серологических маркеров ВГВ использовали тест-системы: BeKTOHBsAg-антитела, «BeKToHBcAg-IgM-сгрип» (ЗАО «Вектор-Бест», Россия), ГепаБест анти-НВс-IgG-CTpHri (ЗАО «Вектор-Бест», Россия), ВектоНВе-антиген-стрип (ЗАО «Вектор-Бест», Россия), ВектоНВе-IgG (ЗАО «Вектор-Бест», Россия).
В работе в качестве HBsAg-стандарта использовали отраслевой стандарт ОСО HBsAg 42-28-311-00 (НПО «Диагностические системы»), содержащий пулированный HBsAg в концентрации 20 ME/ml, и внутрипроизводственный стандарт (ВПС) - афинночищенный пулированный HBsAg субтипа ау, концентрация в котором была определена по ОСО HBsAg.
Поликлональные кроличьи антитела к HBsAg и МАТ-ПХ 11F3, НЮ, НВ4, 5СЗ, 10D10, 5Н7, 4F5, Н2 были получены в лаборатории медиаторов и эффекторов иммунитета НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. В работе также использовали МАТ-ПХ NF5 и NE2 («Сорбент») и Х7 («Фармакс»).
Способность анти-HBsAg конъюгатов взаимодействовать с различными вариантами HBsAg выражали в относительных величинах, используя специально разработанный алгоритм. Для этого оценивали относительную реактивность анти-HBsAg конъюгатов (cpcg) при тестировании каждой «вариант-
ной» сыворотки (s). Значение <pcg характеризует отношение сравнительной реактивности каждого из конъюгатов (eg) с исследуемой сывороткой к сравнительной реактивности этого же конъюгата с HBsAg «дикого» типа (ОСО) с учетом оптимальных разведений. Для этого вначале для каждого конъюгата определяли значение абсолютной величины ОП в реакции с ОСО (Аосо) и с тестируемой сывороткой (As), вычитая соответствующее фоновое значение К-, после чего значение epeg рассчитывали по формуле:
(peg = maxA0C0 х cgAs * cgR7 maxAs x cgA0C0 x maxRs, где maxAoco - абсолютная величина ОП наиболее реактивного конъюгата при тестировании с ОСО; cgAs - абсолютная величина ОП данного конъюгата «cg» при тестировании данной сыворотки «s»; cgRs - степень разведения данной сыворотки «s» при тестировании ее с данным конъюгатом; maxAs -абсолютная величина ОП наиболее реактивного конъюгата при тестировании с данной сывороткой «s»; cgAoco - абсолютная величина ОП при тестировании данного конъюгата «cg» с ОСО; maxRs - степень разведения данной сыворотки «s» для конъюгата с максимальным абсолютным сигналом при тестировании с этой сывороткой.
Критерием отбора сывороток было десятикратное (или более) снижение чувствительности при взаимодействии конъюгатов с исследуемым HBsAg по сравнению с чувствительностью при взаимодействии тех же конъюгатов с HBsAg «дикого» типа.
Вирусную нагрузку ВГВ в полученных изолятах определяли методом количественного real-time PCR с помощью тест-системы «РеалБест ДНК-ВГВ» (ЗАО «Вектор-Бест», Россия) и прибора RotorGene 3000 (Corbett Research, Австралия).
Выделение вирусной ДНК проводили с использованием SDS/EDTA с добавлением протеинкиназы К и экстракцией щелочным фенолом (Sambrook et al., 1989). ДНК ВГВ амплифицировали методом nested-ПЦР в две стадии. На первой стадии использовали два варианта прямых праймеров: 2045-23f (5'-tcacctcaccatacngcactcag), 2694-20f (5'-ggcattaaaccttattatcc) и
один обратный - 1303-21r (5'-tgcgagcaaaacaagcggcta). На второй стадии амплификации использовали следующие праймеры: прямой - 2724-25f (5'-gttaatcattacttccaaacyagac) и обратный - 1276-22Г (5'-ccgcagtatggatcggcagagg). Секвенирование ДНК ВГВ проводили по большому S-гену (пре-Sl, npe-S2, и S-регионам) и участку полимеразного гена с использованием праймеров 2724-25f и 1276-22г. Кроме того, были использованы обратные праймеры 720-21 г (5'-gtgggggaaagccctacgaac) и 433-22r (5'-gaagatgaggcatagcagcagg).
Определение нуклеотидных последовательностей продуктов ПЦР проводили с набором «ABI PRISM Big Dye™ v. 1.1» («Applied Biosystems», США), согласно инструкции изготовителя, с использованием капиллярного автоматического секвенатора «ABI-3100 PRISM™ Genetic Analyzer» («Applied Biosystems», США).
Выравнивание нуклеотидных последовательностей S-гена и сравнительный анализ первичной нуклеотидной последовательности проводили с помощью программы «Vector NTI 9.0». В качестве референсных данных использовались последовательности геномов ВГВ (генотипы А-Н), полученные из GenBank.
Образцы панели с различными вариантами HBsAg разводили донорской сывороткой, не содержащей маркеры ВГВ, до получения концентраций HBsAg 0,25-5 нг/мл.
Статистическую обработку результатов и вариационный анализ проводили с помощью программ «Statistica 6.0» и «Exel». Достоверность полученных результатов определяли с помощью t-критерия Стьюдента.
Алгоритм серологического поиска и серологический анализ HBsAg-вариантных сывороток
Серологический поиск HBsAg-мутантов ВГВ проводили при помощи следующего алгоритма (Рис.1):
На первом этапе предложенного алгоритма проводили скрининг населения на наличие HBsAg и отбирали все выявленные HBsAg-пoзитивныe образцы (сплошная выборка).
Рис. 1. Алгоритм поиска HBsAg-мутантов ВГВ.
На втором этапе для каждой HBsAg-позитивного образца подбирали оптимальное разведение. Оптимальным считали разведение, при котором образец, тестируемый в тест-системе «Гепастрип В», имел оптическую плотность от 0,5 до 2,5. Для сывороток, имеющих более высокие значения ОП, готовили серию 10-кратных разведений (от 1/10 до 1/100000) на растворе К' из набора «Гепастрип В».
На третьем этапе сыворотки в оптимальном разведении параллельно тестировали в четырех иммуноферментных тест-системах для выявления HBsAg: «Гепастрип В», «Вектогеп HBs-антиген», «HBsAg/м», «Murex HBsAg v3». По результатам тестирования для каждой сыворотки подсчитывали коэффициент позитивности (КП) и индекс максимального различия результатов (ИМР) по формулам: КП = ОПобр. / ОПкрит. ИМР = шахКП/штКП, где тахКП - максимальный коэффициент позитивности, полученный в ходе параллельного тестирования образца в одной из 4-х тест-систем; гшпКП -
минимальный коэффициент позитивности, полученный в ходе параллельного тестирования образца в одной из 4-х тест-систем.
В том случае, если значение ИМР было равным или выше 10, сыворотка, как потенциально содержащая НВзА§-мутант ВГВ, отбиралась для дальнейшего изучения. Величина ИМР, использованная в качестве дискриминационного критерия, была определена эмпирически в ходе выполнения первой экспериментальной серии.
На четвертом этапе НВзА§, содержащийся в отобранных сыворотках, анализировали («портретировали») с помощью панели моноклональных и поликлональных aнти-HBsAg тонъюгатов.
На заключительном пятом этапе изучали природу атипичных серологических свойств НВзА путем генотипирования, субтипирования и анализа аминокислотной последовательности HBsAg с точки зрения наличия серологически значимых мутаций.
За период 2004-2005 гг. при проведении скрининга на НВэАд населения трех округов г. Москвы было отобрано 2510 HBsAg-пoзитивныx сывороток (случайная выборка). В ходе параллельного тестирования этих сывороток в рабочих разведениях в четырех тест-системах было выявлено 19 HBsAg-вариантных сывороток с ИМР свыше 10.
Лабораторно-диагностическая характеристика НВ^-еариантных сывороток
HBsAg-вapиaнтаыe сыворотки были охарактеризованы по следующим параметрам: концентрация HBsAg, наличие диагностических серологических маркеров ВГВ-инфекции, уровень вирусной нагрузки (см. Табл.1).
Таблица 1. Лабораторно-диагностическая характеристика HBsAg-вариантных сывороток
Шифр сыв-ки Серологические маокеоы ДНК ВГВ (коп ./мл)
НВвА& мкг/мл* анти-НВзА0 HBeAg анти-НВеА§ анти-НВс-^М анти-НВс-^О
111 95,0 - + ± + 1,71х107
1537 95,0 + + + 2,64x10"
2043 60,0 - - + + + 1 1,86x10"
5144 0,2 - + - + <10
84 0,5 - + + + 2,57x10'
536 85,0 - + + 6,46x10'
716 0,2 - + - + <10
1295 2,0 - + + 6,33x10'
1354 0,2 - + + + 2,56х104
5797 0,2 - + + + 5,95x10'
283 95,0 - + + бАЗ^О"
2323 50,0 - + - + 1,09x10"
1491 70,0 - + + + 4,90x10"
69 60,0 - + + 1.93x10'
243 8,0 + + <10
1234 0,5 + + 5,29x10'
1138 30,0 - - + + + 2,79x10'
1197 10,0 - _ + + l,44xl0J
854 0,2 - - + + + <10
"Концентрацию HBsAg определяли с помощью наиболее чувствительной тест-системы относительно ОСО с учетом разведений.
Сравнительный анализ серологических особенностей HBsAg-вариантных сывороток при помощи панели анти-HBsAg конъюгатов
Расширенный анализ серологических свойств 19 вариантных сывороток проводили при помощи панели, состоящей из 11 моноклональных и 1 поликлонального анти-HBsAg конъюгатов.
Как следует из Табл.2, все вариантные сыворотки по реакции конъюгатов можно распределить на четыре серологические группы. В первую группу вошли сыворотки, которые характеризовались дефектами взаимодействия содержащегося в них HBsAg с большинством исследуемых конъюгатов. Во вторую - большинство сывороток с однотипным дефектом взаимодействия конъюгатов 11F3 и НЮ. В третью - сыворотки с изолированным дефектом по конъюгату NF5. В четвертой группе - сыворотки с неоднотипными дефектами по одному - трем конъюгатам. Из них сыворотка 1138 оказалась похожей на сыворотки второй группы, поскольку содержащийся в ней HBsAg плохо распознавался конъюгатами 11F3 и НЮ. Уникальной характеристикой HBsAg, содержащегося в сыворотке 854, было то, что наряду с дефектами по моноклональным конъюгатам 11F3 и НВ4, он плохо распознавался поликло-нальными кроличьими антителами.
Таблица 2. Характеристика серологических свойств HBsAg-вapиaнтныx сывороток, полученная с помощью набора моноклональных анти-НВзА конъюгатов
й -1 Шифр сыв- ки Относительная реактивность анти-НВвАг конъюгатов
ШЗ ню НВ4 Х7 5СЗ кюю №5 5Н7 N2 4И5 Н2 Поли-АТ
Группа сыво поток!
1. 111 0,00 о.ог б.о'о*'- оде о,«о 0,00 0.04- 0,00 о.оо- - 0,00'-'! 11,30 0,22
2. 1537 0,00 0,02 0.01 0.00 0,00- • 0,00 0,06 0:00 • 0,00' 0.0.6 \ 11,94 0,60
3. 2043 0,00 0.05: 0,00 0,00 0,00 - 0,00 - 0,16 о:оо 0ДО," 0.11 13,50 0,46
4. 5144 0,00 ' 0,04 ОСОО" 0.01= • 0,01- ' 0,ОГ-- 0,24 о;оо-,- 0.00 -' 0,19 10,05 0.78
Группа сыво воток II
5. 84 0,00". 0,06,' 2.13 1,70 1.95 1,89 1,47 2.13 2,45 1,56 3,27 1.32
6. 536 |0,00 - о,да: 1,44 1,52 1,42 1,65 1,31 0,95 0,72 1,23 4,12 0,88
7. 716 ОДО " 0,02 1.79 1,50 1,40 1,54 1,66 1.28 0,62 1,20 3,16 0.67
8. 1295 0,00 • 0,08 1.34 1,50 1,83 1.64 1,47 0,99 0,65 1,29 2,87 0,70
9. 1354 0,00. 0,05 1,52 1,56 1,70 1,72 1,72 0.92 0,54 1.37 3,56 0,78
10. 5797 0,00 0.03, 1,44 1,50 1,54 1.40 1,65 1,05 1,06 1,32 2,58 0,90
11. 283 0,00 0.05'. 1,94 1,97 0,68 1,71 1,73 1,31 1,46 1,67 0,78 1.27
12. 2323 0.00 0,02 1,72 1.65 1,07 2,00 1,08 1.54 0,65 1,45 2,30 Л70
13. 1491 0,00 ' 0,04 1,05 1,39 1,30 1,40 1,40 0,92 0,65 1,03 4,89 0,79
Группа сыво ооток 111
14. 69 1,00 1,33 1,30 1,16 0,69 1,05 0.00 ]0.94 1,22 0,25 0,10 0,81
15. 243 1,00 1,03 1,50 1,41 0,89 1,42 0,00 - 0,86 1,20 0,29 1,45 1,12
16. 1234 И ,00 1 1,01 1,34 1,41 0.34 1,21 0,00 1,06 1,43 0.92 1,56 0.82
Группа сывороток IV
17. 1138 Й*.01 0,01 1.15 11.14 0№>" 1,61 1,66 1,00 1,32 0.64 0,79 0.90
18. 1197 0.89 0,78 0.07 ' 10.11 0,13 1,22 1,65 0.73 1,16 1.37 1,09 1,00
19. 854 0,01- ' 1,31 6.091 11.72 |н/о н/о н/о н/о 0,58 н/о 7,97 0.06
Серым цветом отмечены значения (рсв, отражающие падение чувствительности выявления HBsAg более чем в 10 раз; 0,00 обозначает либо полное отсутствие реакции, либо ее снижение более чем на два порядка; н/о - не определяли.
Таким образом, «особенность» всех сывороток, отобранных с использованием четырех диагностических HBsAg-тecт-cиcтeм по дискриминационному критерию ИМР свыше 10, была подтверждена наличием дефектов распознавания моноклональными конъюгатами.
Генетический анализ изолятов ВГВ, выделенных из HBsAg-вариантных сывороток
Первичную нуклеотидную последовательность генома ВГВ удалось установить для изолятов ВГВ, содержащихся в 9 из 19 HBsAg-вapиaнтныx сывороток. Из остальных 10 HBsAg-вapиaнтныx сывороток не удалось выделить ДНК ВГВ в количестве, достаточном для секвенирования из-за низкой вирусной нагрузки.
Проведенный анализ позволил выявить во всех девяти изолятах серологически значимые мутации 014511 и 5143Ь/Т143М. Три изолята содержали мутацию 014511, пять - Б143Ь и один - Т143М (Табл.3).
Таблица 3. Аминокислотные замены, выявленные в изолятах ВГВ HBsAg-вариантных сывороток
№ сыворотки 111 1537 2043 1295 1354 283 2323 1491 1138
Участок генома Аминокислотные замены
S-ген (1-226 а.к.о. I110N N52S F8L F8L L49P S143L S143L F8L S34L
в S-HBsAg) G145R Q101R Q101R T45N S143L Q30K TI43M
S174N G145R М133Т S143L L49P Y206F
G145R S204N S143L
LI 621 S207R
S193L
S207R
Возникновение мутации G145R (изоляты 111, 1537, 2043) определя-
лось заменой одного и того же нуклеотида в 433 положении G на А с образованием кодона аргинина - AGA. Во всех случаях мутация S143L была обусловлена заменой 427 нуклеотида С на Т с образованием кодона лейцина -TTG. Мутация Т143М (изолят 1138) была обусловлена заменой нуклеотида С на Т в 427 положении с образованием кодона метионина - ATG.
Таблица 4. Генетическая и серологическая характеристика нвба, содержащегося в HBsAg-вapиaнтныx сыворотках
Серологическая Шифр Генотип Субтип Вариабельность S-гена
I 111 D adwi II ION, g14sr. S174N
1537 D avw? N52S, Q101R. g145r
2043 D avvv? F8L. Q101R. M133T. g145r, L162I,
II 1295 D avw? F8L. T45N. s143l, S204N. S207R
1354 D avw? L49P. sj43l
283 D2 aywi s143l
2323 D2 avwi s143l
1491 D avw? F8L, ОЗОК. L49R. s143l
IV 1138 AI adw? S34L, t143m, Y206F
Анализ генотипов и субтипов ВГВ показал, что во всех сыворотках I и
II серологических групп присутствовал ВГВ с генотипом D, тогда как в сыворотке 1138, относящейся к IV группе, ВГВ имел генотип А. При этом все изоляты HBsAg, кроме 111, имели характерные для генотипов D и А субтипы ayw2, ayw3, adw2. У изолята 111 был обнаружен редкий субтип HBsAg adw3.
Сопоставление данных серологического и генетического анализов позволило установить четкую связь между серологическими свойствами HBsAg с той или иной мутацией в S-гене (Табл.4).
Во всех образцах первой серологической группы была выявлена мутация G145R, второй серологической группы - мутация S143L. Генетические особенности изолята 1138 в отношении наличия мутации по 143 а.к.о. (Т143М) подтвердили ее серологическое сходство с группой II.
Таким образом, сопоставление данных генетического и серологического анализа позволило установить характерные сочетания дефектов МАТ-ПХ для каждой из выявленных HBsAg-мутаций.
Серологическое «портретирование» эпитопных модификаций HBsAg по дефектам распознавания нативных и рекомбинантных вариантов HBsAg моноклональными анти-HBsAg конъюгатами
Для проведения серологического анализа эпитопных модификаций HBsAg значения относительной реактивности анти-HBs конъюгатов панели ((peg), полученные для каждого варианта антигена, были представлены в графическом виде. По оси ординат указывали значения (peg, а по оси абсцисс -названия анти-HBsAg конъюгатов панели (цифрами 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11 обозначали моноклональные конъюгаты 11F3, NF5, Х7, 10D10, Н2, НЮ, 4F5, 5СЗ, NE2, НВ4, 5Н7 соответственно, буквой Р - поликлональный анти-HBsAg конъюгат). Таким образом, для каждого варианта HBsAg был получен характерный спектр (серологический «портрет») относительных реактивно-стей анти-HBsAg конъюгатов. Данные серологические «портреты» использовали для анализа эпитопных модификаций различных вариантов HBsAg.
Рис.2. Серологический «портрет» нативного HBsAg, модифицированного мутацией G145R
ill 411
rnr nriiii
На Рис. 2 представлены серологические «портреты» HBsAg первой серологической группы сывороток. Наличие серологически значимой мутации G145R было показано для трех изолятов этой группы: 111, 1537, 2043. Геном изолята сыворотки 5144 секвенировать не удалось. Тем не менее, для всех вариантов HBsAg, содержащихся в данных сыворотках, были получены схожие серологические «портреты». Общим для всех «портретов» явилось значительное (3-4 порядка) снижение величины <pcg для большинства МАТ-ПХ №1(11F3), 3(Х7), 4(10D10), 8 (5СЗ), 9(NE2), 10 (НВ4), 11(5Н7) и умеренное снижение <pcg (примерно в 10 раз) моноклонального конъюгата №2 (4NF5). Так же общим для всех «портретов» этой группы явилось повышение активности (до 10 раз) моноклонального конъюгата №5 (Н2).
На Рис. 3 представлены серологические «портреты» HBsAg второй серологической группы сывороток. Так же как для образцов первой группы, наличие серологически значимой мутации S143L было показано только для части изолятов второй серологической группы: 1295, 1354, 283, 2323, 1491. Геномы изолятов 84, 536, 716, 5797 секвенировать не удалось. Для всех вариантов HBsAg, содержащихся в данных сыворотках, также были получены схожие серологические «портреты», что выразилось в однотипном снижении величины (?cg моноклональных конъюгатов 1 (11F3) и 6 (НЮ).
;п"* г".....
Рис.3. Серологический «портрет» нативного HBsAg, модифицированного мутацией S143L
Анализ с использованием серологического «портретирования» был применен для изучения особенностей эпитопных модификаций рекомби-нантного НВзА§. Нами были изучены рекомбинантные пептиды HBsAg с различными мутационными заменами во второй петле «а»-детерминанты (НПО «Диагностические системы»). Исходя из сходства первичной аминокислотной последовательности, можно было ожидать, что рекомбинантные пептиды, с заменой 0145К, будут иметь серологический «портрет» сходный с таковым для природного аналога. Однако никаких отклонений в реакции моноклональных конъюгатов с данными рекомбинантными пептидами, по сравнению с их реакцией к HBsAg «дикого» типа, не было выявлено.
Аналогично, никаких отклонений не было выявлено также при взаимодействии использованного набора моноклональных конъюгатов с рекомбинантными мутантами ай\у2 ()1291 и айш2 МШЬ, а так же с рекомбинантным HBsAg «дикого» типа.
Взаимодействие различных вариантов НВаА» с aнmu-HBsAg, индуцированных вакцинацией против гепатита В или ВГВ-инфекцией.
Неспособность протективных антител связываться с мутантным HBsAg снижает профилактический потенциал вакцин против гепатита В и эффективность иммунного ответа при инфекции ВГВ. Исходя из этого, нами был разработан подход, позволяющий оценивать способность aнти-HBsAg антител взаимодействовать с различными вариантами HBsAg.
Предложенный подход является модификацией теста нейтрализации, в ходе которого происходит конкуренция различных вариантов HBsAg за связывание со специфическими антителами. Для проведения постановки использовали коммерческий набор реагентов «BeктoHBsAg-aнтитeлa» (производства ЗАО, «Вектор-Бест», Новосибирск). В ходе постановки каждый образец сыворотки, содержащий aнти-HBsAg, тестировали в нескольких лунках, в одну из которых добавляли анализируемый образец без НВзА§, а в другие -тот же образец и различные варианты HBsAg.
При наличии в сыворотке антител, способных связываться с вариантом НВзА§, происходит блокировка антител этим НВзА§. Блокированные антитела не связываются с твердой фазой планшета и удаляются из лунок на стадии промывки. Это приводит к уменьшению количества конъюгата на твердой фазе, и, как следствие, к снижению значений оптической плотности (ОП) в лунке с НВзАд. По результатам тестирования рассчитывали относительную активность анти-НВв, величина которой была прямо пропорциональна способности сывороточных анти-НВэ связываться с данным вариантом HBsAg .
акцинир ов анны е
Переболевшие
| 0.25.
)S143L j ] G 1 45R ) |"Дикий тип"]
a a ^ s i
Is M3L I |G 1 45R I
Рис.4. Активность антител к НВзА§ в сыворотках лиц, вакцинированных против ГВ и переболевших ВГВ-инфекцией
Оценка эффективности взаимодействия анти-HBs с вариантами HBsAg с помощью предложенной методики была проведена в двух группах лиц: привитые вакциной «Энжерикс» и «Твинрикс» (Бельгия) - 20 человек; переболевшие гепатитом В - 12 человек. Из полученных данных (Рис.4) следует, что поствакцинальные анти-HBs эффективно взаимодействовали как с HBsAg «дикого» типа (изоляты № 2505, 2511), так и с мутантным S143L HBsAg (изоляты № 283, 2323) и практически не связывались с мутантным G145R HBsAg (изоляты № 111, 1537, 2043). У переболевших гепатитом В лиц анти-HBs активно взаимодействовали с мутантным G145R HBsAg, но не столь эффективно, как с HBsAg «дикого» типа или с мутантным S143L HBsAg. Все указанные различия были высоко достоверными (р < 0,0001).
Использование контрольной панели сывороточных образцов, содержащих НВ^ мутантов ВГВ, для оценки чувствительности диагностических тест-систем для иммунодетекции HBsAg
Выявленные в ходе проведенной работы сыворотки, содержащие различные варианты мутантного НВзЛ§, были использованы при создании контрольной панели сывороточных образцов. Для проведения сравнительных испытаний взяли 7, широко распространенных в РФ тест-систем.
Во всех испытуемых тест-системах отраслевой стандарт HBsAg детектировался в концентрации 0,125 нг/мл. Это свидетельствовало о высокой чувствительности всех 7 тест-систем в отношении НВзА§ «дикого» типа. Напротив, способность тестов выявлять сыворотки, содержащие мутантный HBsAg, сильно различалась.
Из данных представленных в Табл. 5 следует, что только в двух тест-системах (№1 и 2) удалось выявить все сыворотки панели в минимальной концентрации HBsAg - 0,25 нг/мл. При помощи тест-системы №4 также были выявлены все образцы, однако для сыворотки №2043 в максимальном разведении результат тестирования оказался условноположительным (согласно инструкции к тест-системе). Все три тест-системы, при помощи которых были успешно выявлены образцы панели с мутациями HBsAg С145И и БМЗЬ, имели в своем составе как моноклональные, так и поликлональные антитела.
Таблица 5. Результаты тестирования образцов панели, содержащих му-тантные формы HBsAg
Тест-система Коиц-ция Сигнал/Cut-off
№ Формат (твердая HBsAg, G145R S143L
фаза/конъюгат) нг/мл 1537/ayw2 2043 / ayw2 111 /adw3 283 / ayw3 2323 / ayw3
5 29,55 29,01 27,48 28,11 28,74
МАТ/ПАТ 1 11,98 12,43 12,70 10,27 15,86
0,5 6,40 7,30 5,77 5,32 10,36
0,25 3,51 3,06 3,33 3,24 4,86
5 14,10 15,00 12,20 13.30 17,80
2 2 МАТ/ПАТ 1 8,90 7,70 5,00 8,50 11,10
0,5 5,40 3,50 2,40 6,60 8,40
0,25 3,60 2,80 1,60 4,70 6,20
5 4.91 3,65 4.01 3,30 4,20
1 МАТ / ПАТ 1 3,96 2,44 2,89 1,95 2,94
0,5 3,01 1,81 2,11 1,39 1,88
0,25 2.29 1,17 1,41 1,15
4 MAT 1 ПАТ 5 9,71 5,03 4,39 27,70 55,00
1 2,32 1,29 1,56 7,86 13,10
0,5 1,50 1,27 2,00 3,82 6,74
0,25 1,04 "" 0.0! 1,05 2,21 4,58
5 13,04 10,00 4,57 19,57 20,98
5 ПАТ/3 МАТ 1 3,59 3,15 1,52 6,09 6,41
0,5 3,04 1,85 0.98 3,80 3,91
0,25 1,41 1.09 0.87 2,28 2,28
5 0,7Г - 0,71 : о,71 ; 13,57 25,36
6 МАТ/МАТ 1 - 0,63 .. - , 0,71 * 0,71 - 4,38 7,68
0,5 ,0 71 -• • 0,71 ' " • 0,80 2,59 5,27
0,25 '0,54 ' - 0,63 -0,80' 1,61 2,68
5 - 0,56'*.". ' 0,48 :-0,48 " 1" 10,56 11,83
7 МАТ /МАТ 1 ' 0,56 ' • . -0,48 . 0.'48 1,83 2,62
0,5 >0,56 ~ ..-0.48 0.48 1,43 1,9 8
0,25 " 0,56' ' 0,48 0,48 - -'0,95 л;., 1,03
* выделены негативные результаты тестирования образцов панели
Еще две тест-системы (№ 3 и 5), в составе которых имеются как поли-клональные, так и моноклональныс антитела, также показали удовлетворительные результат, в отличие от тест-систем, основанных исключительно на МАТ. Напротив, в тест-системах №6 и 7, произведенных с использованием только МАТ, были получены отрицательные результаты тестирования образцов, содержащих НВзА§ 014511 даже в максимальной концентрации панели - 5 нг/мл.
Создание тест-системы для серологического выявления HBsAg-мутантое, основанной на двух МА Т анти-НВБА§ конъюгатах 11РЗ и Н2.
Для поиска мутантов ВГВ в НВзА^-положительных образцах, отобранных в ходе скрининга населения, нами была разработана тест-система «Гепа-стрип-мутант». Данная тест-система содержит иммуносорбент - антитела к HBsAg, иммобилизованные в лунках полистиролового планшета, и конъюга-ты двух различных моноклональных антител с пероксидазой хрена: 1) конъ-югат 1 №3, который не реагирует с НВэАз с мутациями в 143 или в 145 положениях; 2) конъюгат Н2, который высоко активно реагирует с НВзА§ с мутациями в указанных положениях. Каждый образец тестируется в двух лунках планшета с различными конъюгатами.
По результатам тестирования сыворотки со схожими значениями ОП относили к «дикому» типу. Если значение ОП образца в лунке с коньюгатом
Н2 превышало ОП образца в лунке с конъюгатом 11РЗ в 10 и более раз, делали вывод о наличии в образце HBsAg с заменами в 145 или 143 положениях.
При помощи тест-системы «Гепастрип-мутант» был проведен поиск НВзА§-мутантов в группе из 160 пациентов ГНЦ РАМН в результате чего удалось обнаружить два HBsAg-пoзи'raвныx образца, содержащих HBsAg с серологическими свойствами, характерными для HBsAg заменой в 143 положении.
Оценка распространенности серологически значимых мутаций HBsAg в Московском регионе
Как следует из Табл.6, частота встречаемости изолятов ВГВ с подтвержденной секвенированием Э-гена заменой в 145 и 143 положениях составила 0,12% и 0,24%, соответственно. Общее количество случаев подтвержденного генетическим анализом случаев носительства мутантов ВГВ составило 0,36%.
Таблица 6. Распространенность HBsAg-мyтaнтoв и серологически атипичных вариантов ВГВ среди 2510 хронических носителей ВГВ
Мутанты по а.к.о. Серологически атипичные варианты ВГВ
145 ИЗ 145+143 всего с «портретами», соответствующими мутациям по 145 или 143 а.к.о.
Количество сывороток 3 6 9 19 14
Частота встречаемости, % 0,12 0,24 0,36 0,76 0,56
Согласно данным серологического анализа доля мутантов ВГВ, экс-прессирующих HBsAg с «серологическими портретами» характерными для мутаций 014511 и БШЬ/ТИЗМ, составила 0,56%, а доля всех потенциально мутантных изолятов ВГВ (HBsAg-вapиaнтныe сыворотки) составила 0,76%.
ВЫВОДЫ:
1. При помощи разработанного алгоритма серологического поиска HBsAg-мyтaнтoв ВГВ выявлен факт циркуляции мутантов ВГВ 014511, БМЗЬ,
Т143М среди хронических HBsAg-позитивных носителей ВГВ Московского региона. Обнаружен мутант ВГВ G145R с редким для генотипа D субтипом adw3.
2. Серологический и генетический анализ HBsAg-мутантов ВГВ позволил установить принципиальную возможность определять мутации G145R, S143L, Т143М по серологическим свойствам HBsAg, что было использовано при создании тест-системы для серологического поиска этих мутантов ВГВ.
3. Анализ антигенных свойств, проведенный при помощи серологического «портретирования» по дефектам моноклональных антител к HBsAg, позволил установить существенные различия природных и рекомбинантных форм мутантного HBsAg.
4. С помощью разработанной панели сывороточных образцов, содержащих мутантные варианты HBsAg, проведена оценка 7 коммерческих ИФА тест-систем разных конструкций по их способности выявлять HBsAg G145R, S143L и показан низкий диагностический потенциал в отношении мутантного HBsAg ИФА тест-систем, основанных исключительно на моноклональных антителах.
5. Установлено практически полное отсутствие антител к мутантному HBsAg G145R у лиц привитых различными вакцинами против ГВ.
Список работ опубликованных по теме диссертации:
1. Суслов А.П., Нестеренко В.Г., Иванова М.В., Вавилова Л.М., Баженов А.И., Годков М.А. Проблемы преодоления неопределенности результатов иммуноферментной диагностики гепатитов В и С скрининговыми и подтверждающими тест-системами.// В кн.: «Гепатит В, С, и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики». - 2003. - С. 275.
2. Баженов А.И., Нетесова И.Г., Годков М.А., Суслов А.П., Эльгорт Д.А., Фельдшеро-ва A.A., Хац Ю.С., Будницкая П.З., Никитина Н.И., Мануйлов В.А., Нетесов C.B. Выявление HBsAg-позитивных образцов с противоречивыми результатами в разных коммерческих тестах.//В кн.: «Медицинские, иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций». - 2004. - С.8.
3. Баженов А.И., Нетесова И.Г., Годков М.А., Суслов А.П., Эльгорт Д.А., Фельдшеро-ва A.A., Хац Ю.С., Будницкая П.З., Никитина Н.И., Мануйлов В.А., Нетесов C.B. Распределение субтипов HBsAg в сыворотках с разноречивыми результатами исследований в тест-системах разных изготовителей.// В кн.: «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». - Украина, Гурзуф, 2004. - №6. - С. 169-170.
4. Нетесова И.Г., Баженов А.И., Годков М.А., Купцова В.Э., Васильев С.Г., Белова Т.Н., Вещенко Т.Г., Косых Л.С., Шмырева H.A., Кундельский Р.В., Калашникова Т.В., Нетесов C.B., Фаворов М.О. Субтипы HBsAg в образцах крови доноров центрального феде-
рального округа (ЦФО) России Л В кн.: « Вирусный гепатит В - диагностика, лечение и профилактика» - 2004. - С. 128-129.
5. Баженов А.И., Нетесова И.Г., Годков М.А., Суслов А.П., Эльгорт Д.А., Фельдшеро-ва A.A., Хац Ю.С., Будницкая П.З., Никитина Н.И., Мануйлов В.А., Нетесов C.B. Чувствительность коммерческих тест-систем для диагностики гепатита В: проблема универсальности распознавания.// В кн.: «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций». - 2004. - С. 18.
6. Баженов А.И., Нетесова И.Г., Мануйлов В.А., Годков М.А., Суслов А.П., Эльгорт Д.А., Фельдшерова A.A., Хац Ю.С., Будницкая П.З., Никитина Н.И., Нетесов C.B. Изучение изолятов ВГВ образцов крови с противоречивыми результатами в разных тест-системах для выявления HBsAg.// В кн.: «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». - Украина, Гурзуф, 2005. - С. 178.
7. Суслов А.П., Баженов А.И., Эльгорт Д.А., Фельдшерова A.A., Годков М.А., Коноп-лева Н.В., Третьяков О.Ю., Хац Ю.С., Будницкая П.З., Никитина Н.И. Обнаружение серологически значимых мутаций вируса гепатита В (ВГВ) методом скрининга по дефектам моноклональных анти-HBsAg коньюгатов (СДМК).// В кн.: «Вирусные гепатиты-проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики». - 2005. - С. 325-326.
8. Баженов А.И., Нетесова И.Г., Мануйлов В.А., Годков М.А., Суслов А.П., Эльгорт Д.А., Фельдшерова A.A., Хац Ю.С., Будницкая П.З., Никитина Н.И., Нетесов C.B. Выявление мутации G145R и необычного субтипа adw3 среди серологических вариантов ВГВ, отобранных по дефектам чувствительности моноклональных aHTn-HBsAg-KOHiroraTOB).// В кн.: «Вирусные гепатиты - проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики». - 2005. - С. 24-25.
9. Баженов А.И. Диагностика «ускользающих» мутантов вируса гепатита В.// Актуальные вопросы профилактики гемотрансмиссивных инфекций в многопрофильном стационаре скорой медицинской помощи: материалы гор. семинара,- Москва: НИИ СП им. Н.В. Склифосовского, 2006,- Т.190. - С.16-19.
Ю.Баженов А.И., Годков М.А., Лапина Н.Е., Коноплева М.В., Эльгорт Д.А., Фельдшерова A.A., Суслов А.П. Сравнительная оценка Способности коммерческих иммунодиаг-ностикумов выявлять HBsAg «ускользающих» мутантов вируса гепатита В (ВГВ).// В кн.: В кн.: «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». - Украина, Гурзуф, 2007. - С. 168-169.
11. Баженов А.И., Годков М.А., Лапина Н.Е., Коноплева М.В., Эльгорт Д.А., Фельдшерова A.A., Суслов А.П. Оценка способности коммерческих ИФА и ПЦР тест-систем выявлять HBsAg-мутантов вируса гепатита В.// В кн.: «Вирусные гепатиты - проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики». - 2007. - С. 5-6.
12. Баженов А.И., Коноплева М.В., Эльгорт Д.А., Фельдшерова A.A., Будницкая П.З., Никитина Н.И., Хац Ю.С., Годков М.А., Суслов А.П. Алгоритм серологического поиска и оценка распространенности серологически значимых мутаций у носителей вируса гепатита В. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2007. - №6. - С.30-37.
13. Суслов А.П., Баженов А.И., Годков М.А., Эльгорт Д.А., Фельдшерова A.A., Коноплева М.В., Туполева Т.А., Голосова Т.В. HBsAg-мутанты вируса гепатита В и их роль в эволюции вируса и вирусной онкопатологии.// Журнал Медицинская иммунология. «Тезисы Объединенного иммунологического Форума - 2008», Санкт-Петербург. - 2008. - С.121.
Н.Баженов А.И., Коноплева М.В., Фельдшерова A.A., Эльгорт Д.А., Хац Ю.С., Годков М.А., Суслов А.П. Оценка эффективности взаимодействия анти-HBs антител с различными вариантами HBsAg.// В кн.: В кн.: «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». - Украина, Гурзуф, 2008, С.168-169.
15. Баженов А.И., Коноплева М.В., Фельдшерова A.A., Эльгорт Д.А., Хац Ю.С., Лапина Н.Е., Годков М.А., Суслов А.П. Оценка чувствительности коммерческих тест-систем для иммунодетекции HBsAg по их способности выявлять HBsAg-мутанты вируса гепатита В.//Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2008. -№3. - С.49-53.
Заказ №585. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз.
Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru
