Применение полимеразной цепной реакции (ПЦР) для лабораторной диагностики привело к революционному развитию группы диагностических методов, основанных на выявлении генетического материала и объединяемых общим термином «генодиагностика». Присущая ПЦР высокая специфичность анализа обусловлена использованием для её проведения уникального фрагмента генома возбудителя инфекционного заболевания, не встречающегося у других организмов. Важно также, что ПЦР – прямой метод лабораторной диагностики, т. е. обнаружение нуклеиновой кислоты вируса эквивалентно обнаружению вирусных частиц.
Рис. 1. Принцип ПЦР в режиме реального времени.
Детекция накопления ампликонов происходит при помощи олигонуклеотидного зонда, гибридизующегося с участком мишени между праймерами. Зонд несет на себе флуорофор (F) и блокирующий флуоресценцию гаситель (Q), расположенный рядом с ним. В ходе синтеза комплиментарной цепи полимераза расщепляет зонд, в результате чего возникает флуоресценция.
Общий принцип ПЦР основан на многократном увеличении (амплификации) числа копий целевого специфического фрагмента ДНК (ДНК-мишени или матрицы) ферментом ДНК-полимеразой. Для синтеза новых комплиментарных цепей ДНК-полимераза использует в качестве затравки синтетические одноцепочечные олигонуклеотиды (праймеры), ограничивающие амплифицируемый фрагмент с двух сторон (рис. 1).
Реакцию проводят в условиях многократного (25.50 раз) повторения температурного цикла, включающего следующие стадии:
1. Денатурация - разогрев реакционной смеси до высокой температуры (обычно 94.95°С), при которой диссоциируют все комплексы ДНК, в том числе расплетается и двойная спираль ДНК-мишени;
2. Отжиг праймеров, или гибридизация - смесь охлаждается до температуры, при которой праймеры образуют двуцепочечный комплекс с ДНК-мишенью;
3. Элонгация – удлинение цепей ДНК, приводящее к удвоению ДНК-полимеразой специфического фрагмента ДНК.
Использование для ПЦР термостабильного фермента (обычно применяют Taq-полимеразу из бактерии Thermus aquaticus или ее рекомбинантные модифицированные варианты) позволяет многократно повторять цикл амплификации с сохранением активности фермента. Скорость элонгации Taq-полимеразой максимальна при температуре 72°С. При отсутствии факторов, препятствующих эффективной амплификации, за один цикл количество копий специфического участка ДНК-мишени (ампликонов) увеличивается вдвое, а после 30 циклов . более чем в 109 раз. Благодаря этому ПЦР нашла применение в лабораторной диагностике для определения настолько малых количеств патогенных микроорганизмов, надежное выявление которых без амплификации невозможно. Теоретически при помощи ПЦР можно обнаружить единичную молекулу ДНК-мишени. На практике для достоверного анализа необходимо присутствие в пробирке с реакционной смесью нескольких десятков копий специфической ДНК.
Рибонуклеиновая кислота (РНК) не может непосредственно выступать в качестве матрицы для ПЦР. С целью выявления специфической вирусной РНК, например ВИЧ или вируса гепатита С, перед проведением амплификации необходимо предварительно получить ДНК, комплиментарную соответствующему участку РНК (кДНК). Эту реакцию обратной транскрипции (ОТ) катализирует фермент обратная транскриптаза (ревертаза).
Задача обнаружения целевой ДНК-мишени в исследуемой пробе с помощью ПЦР, таким образом, сводится к детекции образующихся после окончания амплификации продуктов – ампликонов. С этой целью используют электрофорез в геле или гибридизационный иммуноферментный анализ (ГИФА). В начале 1990-х годов был создан новый метод детекции ампликонов в режиме реального времени (Real-Time PCR), благодаря которому появилась возможность корректного определения количества исходной ДНК-мишени в пробе [1].
В современной лабораторной диагностике Real-Time PCR активно внедряется в качестве метода выявления специфических фрагментов генетического материала патогенных микроорганизмов [2] и постепенно вытесняет варианты ПЦР с детекцией продуктов амплификации по окончании реакции. Принципиальным преимуществом является возможность осуществления детекции накопления ампликонов без открывания пробирки, что минимизирует риск получения ложноположительных результатов из-за контаминации проб и реагентов продуктами амплификации. Существенное уменьшение количества манипуляций с исследуемым образцом сокращает затраты времени, упрощает анализ и позволяет снизить вероятность ошибок. Применение наряду с праймерами гибридизационных зондов обеспечивает повышение специфичности анализа (рис. 1). Возможность независимой одновременной регистрации флуоресцентного сигнала от нескольких гибридизационных ДНК-зондов допускает выявление в одном исследовании нескольких различных участков одной или различных ДНК-мишеней. Но главная особенность Real-Time PCR, позволившая этой методике занять особое место среди методов лабораторной диагностики, – возможность определения исходного количества копий специфической ДНК-мишени в клинической пробе.
Разработано множество способов регистрации амплификации в реальном времени. В диагностических ПЦР-наборах наиболее часто применяются методики с использованием комплиментарных ампликону флуорогенных зондов типа TaqManTM [3] или типа молекулярных маячков (molecular beacons), интенсивность флуоресценции которых изменяется пропорционально накоплению ампликона (рис. 1) и регистрируется в реальном времени специальными приборами –амплификаторами с оптическим модулем.
Принципы количественной оценки в Real-Time PCR и их ограничения
Алгоритм определения количества целевой ДНК в пробе основан на одновременном анализе исследуемых проб и образца сравнения, содержащего выявляемую ДНК-мишень в известной концентрации, и сравнении числа циклов амплификации, необходимых для нарастания сигнала флуоресценции в них до одной и той же величины. Теоретически концентрация ампликонов при многократном повторении температурного цикла должна возрастать, подчиняясь простой экспоненциальной зависимости:
Xn = X0 x 2n , (1)
где X0 – стартовое количество ДНК-мишени, Xn – концентрация ампликонов после n циклов.
Рис. 2. График нарастания флуоресценции при амплификации после сглаживания. Стадии накопления ампликона в ходе ПЦР. Установление порогового значения и определение пороговых циклов для неизвестной пробы (Ct1) и образца сравнения (Ct2).
На практике накопление ампликонов постепенно замедляется и достигает некоторого постоянного значения. Процесс амплификации принято разделять на три основные стадии ПЦР (рис. 2):
1. Стадия экспоненциального накопления (log-фаза), во время которой эффективность амплификации максимальна, а накопление ампликонов связано с начальным количеством копий ДНК-матрицы формулой (2):
Xn = X0 x (1 + E)n, (2)
где Е – эффективность амплификации. (Принято считать, что значение Е = 1 или 100% соответствует удвоению количества продукта за цикл, а при Е = 0 образование продукта не происходит.)
2. Стадия выхода на плато, иногда называемая линейной фазой, во время которой под действием ряда факторов эффективность амплификации постепенно снижается.
3. Стадия плато, при которой прекращается накопление продукта амплификации (Е = 0).
Таким образом, задача первого этапа определения количества ДНК-мишени в исследуемой пробе по формуле (2) состоит в надежном выявлении начальных участков накопления ампликонов на графике увеличения сигнала флуоресценции. Однако помимо флуоресценции, возрастающей пропорционально синтезу ампликонов, прибор регистрирует фоновую флуоресценцию, величина которой зависит от свойств меченых зондов и особенностей регистрирующей аппаратуры, что затрудняет регистрацию именно начального участка.
Достоверное превышение величины целевого сигнала от ампликонов над фоновой флуоресценцией и шумами (рис. 2) позволяет по графикам нарастания флуоресценции, полученным после вычитания фона и сглаживания, установить некоторое пороговое значение флуоресценции (RT), одинаковое для всех совместно анализируемых проб. Корректное установление RT (выше порога детекции, но в пределах log-фазы) осуществляется вручную или при помощи программы амплификатора.
Если для исследуемых проб определить значение порогового цикла (Ct – от англ. threshold cycle – число раундов амплификации, необходимое для достижения порогового значения), то для любого исследуемого образца k при пороговом значении RT верна формула:
RT = A x X0k x (1 + Ek)Сtk , (3)
где А – константа (коэффициент пропорциональности).
Из формулы (3) следует, что чем меньше стартовое количество копий ДНК-мишени (X0), тем большее число циклов амплификации (Ct) необходимо для достижения порогового значения. Характеристики приборов, наиболее широко используемых в клинической диагностике для Real-Time PCR, таковы, что для детекции единичных копий ДНК-мишени в исследуемой пробе требуется 35–37 циклов амплификации.
Для проведения количественного анализа необходимо параллельно провести ПЦР-анализ для неизвестной пробы (1) и пробы сравнения, в которой исходная концентрация ДНК-мишени известна (2), корректно определить разницу значений Ct1 и Ct2 и при условии одинаковой эффективности амплификации вычислить количество копий ДНК-мишени в неизвестной пробе по формуле:
X01 = X02(1 + E)Сt2–Ct1, (4)
Применение формулы (4) предполагает возможность надежного установления порогового значения флуоресценции (RT) в пределах log-фазы и значений порогового цикла (Ct) для всего диапазона определяемых концентраций ДНК-мишени. Кроме того, требуется совпадение эффективности амплификации для анализируемой пробы и образца сравнения, но данное условие может не выполняться, поскольку Е может зависеть не только от условий ПЦР, но и от концентрации ДНК-мишени и других особенностей анализируемого образца. По формуле (3) можно вычислить эффективность амплификации для каждого образца в log-фазе, однако это требует проведения математического анализа индивидуальных графиков нарастания флуоресценции [4] и поэтому редко используется в клинической диагностике.
Альтернативный метод количественного определения ДНК-мишени основан на одновременном анализе исследуемых проб и серии калибровочных образцов с вычислениями по калибровочным графикам. Однако их построение при небольших сериях, как правило, не более 24 образцов, затруднительно по экономическим соображениям. Поэтому для лабораторной диагностики с использованием Real-Time PCR перспективно применение более простых алгоритмов анализа, требующих минимального количества постановок на одну клиническую пробу (в идеале – одна постановка на каждую пробу плюс отрицательный и положительный контроли).
Рис. 3. Калибровочный график.
Образцы 4.8 входят в линейный диапазон, остальные находятся за его пределами. Угол наклона линейного участка калибровочного графика позволяет определить эффективность амплификации.
Если диагностические наборы обеспечивают высокую внутрисерийную воспроизводимость анализа, то имеется возможность проводить вычисления количества копий ДНК-мишени в неизвестной пробе по приведенному в паспорте калибровочному графику. При постоянном значении эффективности амплификации в некотором диапазоне определяемых концентраций калибровочный график представляет собой линейную зависимость величины порогового цикла от логарифма количества копий ДНК-мишени (рис. 3). При соответствующей оптимизации метод Real-Time PCR позволяет на высокоочищенных от примесей пробах проводить количественный анализ в линейном диапазоне до 10 порядков разницы между минимальными и максимальными определяемыми концентрациями (диапазон 10 lg).
Более того, для линейного диапазона определяемых концентраций можно вычислить эффективность амплификации для дальнейших вычислений по формуле (4).
Если представить концентрации в шкале десятичного логарифма, то тангенс угла наклона калибровочного графика b = lgX0n/Ctn , и по формуле (3) получаем 1 + E = 10b, т. е. для эффективности, выраженной в процентах: Е (%) = (10b – 1) x 100%.
Таким образом, процесс анализов предполагает следующие этапы:
- Предварительное проведение для серии наборов контроля эффективности амплификации для применяемого амплификатора с помощью калибровочных образцов;
- Параллельный анализ исследуемых образцов и образца сравнения (с известной концентрацией ДНК-мишени);
- Вычисление содержания ДНК-мишени в исследуемых образцах по формуле (4) в пределах линейного диапазона.
Предложенный упрощенный алгоритм количественного определения содержания ДНК-мишени в анализируемых пробах позволяет значительно увеличить производительность анализа и удобство вычислений. Но для применения такого алгоритма диагностические наборы должны удовлетворять следующим повышенным требованиям:
- постоянная эффективность амплификации (в log-фазе) во всем диапазоне определяемых концентраций (обеспечивается при разработке набора за счет молекулярного дизайна системы праймеров и зонда и оптимизации составов и протокола амплификации);
- повышенная внутрисерийная воспроизводимость анализа (достигается стабилизацией компонентов и применением полных готовых ПЦРсмесей).
Основные факторы, приводящие к ошибкам
количественного ПЦР-анализа
Описанный алгоритм определения концентрации ДНК-мишени даже при соблюдении вышеуказанных условий не исключает ошибок при анализе клинических проб.
В процессе ПЦР существует ряд факторов, способных привести к снижению эффективности амплификации: конкуренция между реассоциацией цепей ДНК и их гибридизацией с праймерами и зондами; постепенная температурозависимая деградация полимеразы; истощение компонентов реакционной смеси (праймеры, dNTP, ДНК-зонды); ассоциация молекул полимеразы с образующимися ампликонами, в том числе и продуктами неспецифического синтеза; изменение эффективной концентрации ионов магния; нецелевое расходование праймеров и dNTP; ингибирование ПЦР продуктом реакции (неорганический пирофосфат, двуцепочечная ДНК). Вносят свой негативный вклад также и объективные недостатки оборудования, например, погрешности измерений интенсивности флуоресценции и определения значений Ct. Действие этих факторов преодолевается при конструировании наборов за счет выбора праймеров и зондов, оптимизацией ПЦР-смеси и протокола амплификации, а также стабилизации компонентов.
Отдельную проблему представляет генетическая изменчивость анализируемых патогенов, в особенности РНК-вирусов, так как при изменениях в структуре выявляемого участка генома возбудителя эффективность ПЦР может быть значительно снижена. Решению этой проблемы посвящены непрекращающиеся усилия разработчиков по усовершенствованию диагностических наборов с учетом новых возникающих геновариантов анализируемых патогенов.
Погрешности количественного анализа могут быть обусловлены индивидуальными особенностями клинических проб: степенью деградации генетического материала, долей ДНК/РНК хозяина, присутствием ингибиторов. Более того, на преаналитической стадии и этапе пробоподготовки к ошибкам могут приводить потери и деградация выявляемых нуклеиновых кислот, прежде всего РНК. В некоторой степени эта проблема может быть учтена при применении в анализе контрольных образцов.
Особенности применения контрольных образцов в количественном ПЦР-анализе
В Real-Time PCR используются положительные, отрицательные и внутренние контрольные образцы (ПКО, ОКО и ВКО, соответственно). При проведении исследования серии образцов ПКО и ОКО анализируются как отдельные пробы. Аликвота ВКО вносится в каждую анализируемую пробу и проходит все стадии анализа, включая пробоподготовку, а процесс амплификации ДНК (или кДНК) ВКО регистрируется в отдельном канале при другой длине волны флуоресценции.
В количественном ПЦР-анализе ПКО и ВКО несут дополнительную нагрузку по сравнению с «классическим» вариантом, предполагающим детекцию по окончании реакции. Положительные контрольные образцы с известной концентрацией ДНК или РНК, аттестованные относительно стандартного образца, могут выступать в роли образцов сравнения. Серия ПКО с различным содержанием ДНК-мишени (такие ПКО обычно называют калибраторами) может применяться для построения калибровочного графика и оценки линейности в диапазоне определяемых концентраций.
Количественный анализ ВКО при должной оптимизации позволяет в каждой пробе оценивать потери выявляемой ДНК (или РНК) на стадии пробоподготовки, а также определить снижение эффективности за счет ингибиторов ОТ или ПЦР. Такая особенность применения ВКО предъявляет к нему дополнительные требования:
1. Амплификация ДНК ВКО должна проис- ходить и регистрироваться независимо от присутствия и количества целевой ДНК-мишени в реакционной смеси для всего диапазона определяемых концентраций, т. е. ВКО должен быть не- конкурентным;
2. Эффективность амплификации ДНК ВКО и исследуемых проб должна быть одинаковой, а ее количество должно соответствовать линейному участку диапазона определяемых концентраций ДНК-мишени;
3. В случае диагностики инфекций, вызываемых РНК-содержащими вирусами, в состав ВКО должен входить целевой фрагмент специфической РНК, из которой перед проведением ПЦР будет синтезирована кДНК посредством обратной транскрипции. Применение ВКО на основе ДНК-конструкций при количественном анализе РНК не позволяет учитывать ее потери за счет повышенной физической и ферментативной деградации, а также контролировать процесс обратной транскрипции. Поскольку свободная РНК в растворах менее стабильна, чем вирусная РНК, для применения в контрольных образцах разработана технология «защищенной РНК» (armored RNA), получаемой генноинженерными методами в виде рекомбинантных РНК-содержащих бактериофагов [5].
Правильный дизайн и использование ВКО позволяет значительно повысить достоверность количественного анализа. В реальной ситуации при анализе клинических проб применение современных методических приемов позволяет уменьшить совокупную погрешность анализа до значений 0,1–0,2 lg. Такой точности достаточно для решения актуальных клинических задач.
Количественная ПЦР открывает перспективы для решения широкого спектра задач клинической лабораторной диагностики: контроль уровня бактериальной обсемененности слизистых оболочек, выявление ассоциированных с развитием опухолей онкогенов, сравнительная оценка экспрессии генов в норме и при патологических состояниях. Важнейшей сферой применения ПЦР с детекцией в режиме реального времени является определение вирусной нагрузки (количество копий генетического материала вирусного патогена в анализируемом объеме сыворотки или плазмы крови) для назначения противовирусной терапии и мониторинга ее эффективности.
В клинической практике особое значение имеет количественное определение возбудителей таких инфекций с парентеральным путем передачи, как ВИЧ-инфекция и вирусные гепатиты В и С. Аналогичные исследования имеют диагностическую значимость для заболеваний, вызываемых цитомегаловирусом и парвовирусом B19. Целесообразность определения вирусных нагрузок обсуждается для некоторых других герпесвирусов (HHV6-8 и вируса Эпштейна-Барр).
Литература
- Higuchi R. // Biotechnology. 1993. № 11. P. 1026–1030.
- Mackay I.M. // Nucleic Acids Research. 2002. V. 30, № 6. P. 1292–1305.
- Bustin S.A. // Expert Rev. Mol. Diagn. 2005. V. 5, № 4. P. 493–498.
- Rebrikov D.V., Trofimov D.Y. // Appl. Biochem. Microbiol. 2006. V. 42, № 5. P. 455–463.
- Hoorfar J. et al. // J. Clin. Mirobiol. 2004. V. 42, № 5. P. 1863–1868.
